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醫(yī)學(xué)魔改大師玩跨界，CRISPR遇見分子診斷

發(fā)布時間：2022-01-19

引言

2020年，瑞典皇家科學(xué)院將諾貝爾化學(xué)獎授予Jennifer Doudna教授Emmanuelle Charpentier博士以表彰她們在CRISPR/Cas9基因編輯方法上所做出的貢獻(xiàn)。得益于此，基因療法隨之大放異彩，在很短的時間內(nèi)完成了由基礎(chǔ)理論到初步科學(xué)驗證，再到實際應(yīng)用的快速發(fā)展。但這一科學(xué)技術(shù)卻也一直伴隨著爭議的聲音，給人無限遐想的同時，也帶來一些隱憂。瑕不掩瑜，這些暫時的爭議阻擋不了人類對于這一充滿潛力的新技術(shù)擴(kuò)展應(yīng)用的嘗試。近年來，以基因編輯而聞名的生物技術(shù)正被用于開發(fā)便攜式、家庭式的傳染病和癌癥測試等分子診斷領(lǐng)域。CRISPR/Cas的神秘面紗正在被緩緩揭開。

安永生命科學(xué)與醫(yī)療健康行業(yè)課題組對話專家，帶你走近：CRISPR/Cas基因編輯遇見分子診斷。

專家介紹

張明東博士

現(xiàn)任波士頓科學(xué)亞太區(qū)首席醫(yī)務(wù)官及醫(yī)學(xué)事務(wù)和衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)副總裁

前美國食品藥政管理局醫(yī)務(wù)官和流行病學(xué)家

曾任職香港中文大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授

美國國立衛(wèi)生研究院國立癌癥研究所博士后

美國貝樂醫(yī)學(xué)院分子病毒學(xué)博士

“CRISPR/Cas技術(shù)是一種逆天改命的手段，讓人產(chǎn)生很多瑰麗和美好的遐想。”

王弢博士

中國抗癌協(xié)會腫瘤標(biāo)志專業(yè)委員ctDNA技術(shù)專家委員會副組長

江蘇省腫瘤分子診斷工程技術(shù)研究中心主任

蘇州大學(xué)（特聘-產(chǎn)業(yè)方向）教授

復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)博士

“CRISPR的應(yīng)用，起步于醫(yī)學(xué)，終將不止于醫(yī)學(xué)?！?/p>

對話專家

CRISPR/Cas一直存在爭議，您建議安永公眾號的讀者如何正確理解這一技術(shù)？

張明東：

CRISPR是原核生物基因組內(nèi)的一段重復(fù)序列。Cas基因則位于CRISPR基因附近，或散布于基因組其他地方，該基因編碼的蛋白均可與CRISPR序列區(qū)域共同發(fā)生作用。因此，該基因被叫做CRISPR關(guān)聯(lián)基因，即Cas。

生命進(jìn)化史上，某些細(xì)菌為了將入侵的病毒基因清除，進(jìn)化出CRISPR/Cas基因剪切防御系統(tǒng)，能夠在遭到病毒入侵后，把病毒基因的一小段存儲到自身 DNA 里稱為 CRISPR 的存儲空間中。這樣，當(dāng)病毒再次入侵時，細(xì)菌便可以根據(jù)存儲的片段識別病毒，并將病毒的DNA切斷達(dá)到抑制作用。這一機(jī)制真正體現(xiàn)了生命之間的微妙平衡，相生相克又不斷進(jìn)化。

CRISPR/Cas技術(shù)的發(fā)明，為臨床醫(yī)學(xué)提供了超越以往的工具。原本不可治愈的疾病有了治愈的可能，比如基因變異導(dǎo)致的各類型遺傳疾病、HIV等難以根治的病毒感染，糖尿病易感性人群的基因改造等，甚至還有可能成為更有效的癌癥治療手段。不夸張地說，CRISPR/Cas技術(shù)可以被稱為是一種逆天改命的手段，讓人產(chǎn)生很多瑰麗和美好的遐想。

然而，重大的科技發(fā)現(xiàn)常常伴有不容忽視的兩面性。火藥的發(fā)明，不僅帶來礦產(chǎn)開發(fā)、道路建設(shè)等生產(chǎn)力的提升，也招致槍械帶來的巨大人員傷亡；20世紀(jì)最偉大的發(fā)現(xiàn)“相對論”，開啟了高效、清潔的核能應(yīng)用，卻也讓人們籠罩在原子彈的陰霾之下。對CRISPR基因編輯技術(shù)來說，它使科學(xué)家擁有改造人類疾病基因或消滅生物的能力，也帶來不受倫理管控下生物武器泛濫甚至畸形生物變異的可能性。這一技術(shù)發(fā)明無疑是人類自火器時代到核能時代以來所面臨的最嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

王弢：

CRISPR技術(shù)開啟了基因編輯的大幕！這是一項了解生命本質(zhì)、挽救生命甚至創(chuàng)造生命的革命性技術(shù)，期待在全球科學(xué)技術(shù)人員的不懈努力下，發(fā)揮它最大的價值，逐步實現(xiàn)讓人類遠(yuǎn)離眾多疾病折磨，實現(xiàn)更健康和更長壽生活的更多應(yīng)用。2020年新冠疫情突然爆發(fā)，恰此時mRNA疫苗大獲成功，mRNA治療藥物獲得快速發(fā)展。突破性的生物技術(shù)不斷涌現(xiàn)，“21世紀(jì)是生物技術(shù)時代”的預(yù)言正在成為現(xiàn)實?！?/p>

誠如明東博士所言，作為這個時代光彩奪目明珠的CRISPR有兩面性，如何防范這個魔法無窮的工具不被惡意群體肆意濫用，是人類大家庭必須直面的共同課題。我始終相信，每一次技術(shù)突破的洗禮，帶給人類的不僅是生產(chǎn)力的巨大提升，更是人類不斷認(rèn)知自然和自身的過程，相信在CRIPSR等生物技術(shù)的加持下，人類將會擁有更美好的家園。

對于11月12日《Nature Communication》上發(fā)表的關(guān)于CRISPR/Cas9基因編輯或許會讓細(xì)胞產(chǎn)生與癌癥相關(guān)的基因突變形式，您覺得對產(chǎn)業(yè)界的影響是什么？

張明東：

CRISPR技術(shù)自問世以來，就獲得“基因魔剪”的稱號，在醫(yī)學(xué)科研領(lǐng)域可以說是百花齊放、碩果累累，同時在農(nóng)業(yè)、環(huán)境等領(lǐng)域也展現(xiàn)了光明的前景。2020年發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas技術(shù)的科學(xué)家Jennifer Doudna教授和Emmanuelle Charpentier博士榮獲諾貝爾化學(xué)獎，這是諾貝爾獎歷史上少見的從發(fā)現(xiàn)到獲獎僅數(shù)年的現(xiàn)象，也說明這是一項多么重要的發(fā)現(xiàn)。

近期，數(shù)篇Nature子刊文章提示，CRISPR會在體內(nèi)引起不可預(yù)測的的脫靶效應(yīng)，甚至癌癥相關(guān)的突變。因而，CRISPR技術(shù)到底是“魔剪”還是“亂剪”，一時眾說紛紜。從CRIPSR技術(shù)偏靶造成的異常突變而言，這只是這項革命性技術(shù)在應(yīng)用中的一個插曲，說明現(xiàn)在的CRISPR編輯技術(shù)還不夠精準(zhǔn)，還需要更多優(yōu)化。需要進(jìn)一步優(yōu)化到單堿基編輯，優(yōu)化到特定部位的單堿基編輯，實現(xiàn)更精細(xì)精確的基因編輯操作。所以我想，大家不要因為目前CRISPR技術(shù)有一些瑕疵，就下結(jié)論說它多么不堪或者多么危險。這些瑕疵是完全可以克服的，只是時間長短的問題。

王弢：

CRISPR技術(shù)出現(xiàn)后，作為一項通用的技術(shù)，在實際應(yīng)用的領(lǐng)域或方向必然存在一些瑕疵，這是十分正常的，需要的是科研人員不斷嘗試、不斷改進(jìn)，逐步實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)應(yīng)用。如果都是一路順風(fēng)，我想那才是需要每個人擔(dān)心的。每個細(xì)分方向或具體疾病應(yīng)用的CRISPR關(guān)鍵細(xì)節(jié)技術(shù)的開發(fā)，需要再多一點時間，我們會看到更多的實際結(jié)果，可能許多不可治療的疾病都將變?yōu)榭芍斡募膊?，這一天并不遙遠(yuǎn)。總體而言，CRISPR的應(yīng)用，起步于醫(yī)學(xué)，終將不止于醫(yī)學(xué)。

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能否談一談CRISPR技術(shù)目前較為成熟的醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，在哪些方面為人類帶來福音？

張明東：

目前進(jìn)展明顯的治療領(lǐng)域，主要包括：

①癌癥治療，主要針對免疫細(xì)胞改造，突變細(xì)胞的基因修補或切除等，有多個臨床研究，部分獲得積極的結(jié)果。

②遺傳疾病，比如亨廷頓氏舞蹈癥病(Huntington ' s disease)、杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD基因）等已有研究報道，進(jìn)展到臨床II期及之后也有報道，但還需要公布相關(guān)臨床數(shù)據(jù)。

③3HIV等病毒的體內(nèi)整合感染方面的應(yīng)用，我想這是近期科研人員比較有把握會有重要進(jìn)展的領(lǐng)域，值得大家關(guān)注。

王弢：

在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，CRISPR-based核酸檢測技術(shù)最有可能成為新一代的分子診斷平臺，尤其在遠(yuǎn)離PCR實驗室場景下的應(yīng)用。

醫(yī)學(xué)診斷是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)疾病的入口，提供了疾病的快速預(yù)警和精準(zhǔn)診斷，讓治療有針對性的明確目標(biāo)。數(shù)十年來，核酸檢驗領(lǐng)域，真正得到廣泛應(yīng)用的技術(shù)僅有PCR和NGS，它們當(dāng)中一個實現(xiàn)了單靶標(biāo)或少靶標(biāo)檢驗，一個實現(xiàn)了多靶標(biāo)并行檢驗。兩者都依賴于大型醫(yī)學(xué)檢驗實驗室、專業(yè)操作和大型儀器的應(yīng)用場景，是一種遠(yuǎn)離疾病人群個體和現(xiàn)場的檢驗。

而快速準(zhǔn)確診斷感染性疾病應(yīng)用是目前緊迫的需求，是指導(dǎo)疫情防控，保障公共衛(wèi)生安全，避免大范圍傳播的關(guān)鍵。這一點無論是對大型醫(yī)療中心，還是在缺醫(yī)少藥的基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)，或是欠發(fā)達(dá)的國家和地區(qū)都至關(guān)重要。理想的診斷方式應(yīng)該價格低廉、準(zhǔn)確性高、快速、操作簡便（無需專業(yè)人士操作）以及無需專業(yè)設(shè)備和基礎(chǔ)設(shè)施要求。

從我個人的意見以及我們的實踐來看，CRIPSR-based核酸檢測技術(shù)是第一個能真正實現(xiàn)精確、現(xiàn)場甚至居家自測的醫(yī)學(xué)應(yīng)用級診斷平臺。

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如何認(rèn)識CRISPR-based診斷技術(shù)，它有哪些重要突破？能否談一談該技術(shù)目前較為成熟的應(yīng)用領(lǐng)域，在哪些方面為人類帶來福音？

張明東：

CRISPR/Cas技術(shù)以出眾的基因編輯能力聞名于世，但顯然它的技術(shù)應(yīng)用范圍絕不僅限于基因編輯。CRISPR/Cas技術(shù)的創(chuàng)立者之一Jennifer Doudna教授早在2017年就將該技術(shù)應(yīng)用于RNA檢測，創(chuàng)辦Mammoth Biosciences公司，利用Cas12a的非特異性ssDNA降解能力開發(fā)出新的核酸快速檢測方法。幾乎同時，CRISPR研究先鋒者之一的華人科學(xué)家張鋒教授于2017年創(chuàng)辦Sherlock BioSciences公司，利用Cas13蛋白的天然RNase活性改進(jìn)，建立了快速核酸檢測SHERLOCKTM（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter unlocking）平臺。

2021年，基于CRISPR檢測平臺被美國《Science》雜志譽為“下一代分子診斷技術(shù)”! CRISPR顛覆傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)：一張紙、幾分鐘，即可診斷疾?。≡摷夹g(shù)將在病原檢測、疾病篩查、精準(zhǔn)醫(yī)療等眾多領(lǐng)域展現(xiàn)巨大的應(yīng)用潛力。

王弢：

Mammoth Biosciences的“DETECTR BOOST”技術(shù)平臺，可在30分鐘內(nèi)獲得診斷結(jié)果。Sherlock Biosciences開發(fā)了首個獲美國FDA緊急使用授權(quán)的基于CRISPR技術(shù)新冠病毒測試，被評為2021年“全球最具創(chuàng)新力10大生物技術(shù)公司”之一。

在國內(nèi)，有多家生物技術(shù)公司參與開發(fā)了CRISPR-based核酸檢測技術(shù)的新冠病毒診斷產(chǎn)品，主要還是集中于醫(yī)學(xué)實驗室場景下的操作。為真生物開發(fā)了恒溫擴(kuò)增+CRISPR聯(lián)合應(yīng)用的小型化單人份裝置，首次實現(xiàn)基于CRISPR新冠病毒核酸的單人自測或現(xiàn)場快檢，除應(yīng)用于國內(nèi)渠道外，也在積極申報美國FDA緊急使用授權(quán)（EUA）。

CRISPR-based快速檢測可實現(xiàn)各類微生物的居家自測或現(xiàn)場檢驗，類似于現(xiàn)在家用的血糖監(jiān)測。我想，在不遠(yuǎn)的將來，一種全新的醫(yī)療形態(tài)將會逐步呈現(xiàn)。

張明東：

目前CRISPR-based核酸檢測技術(shù)具有明顯的高靈敏度和高特異性的優(yōu)勢，已實現(xiàn)1copy/μL檢測，甚至高于常規(guī)的熒光PCR，在病原體檢測如SARS-CoV-2檢測方面已實現(xiàn)臨床應(yīng)用。

應(yīng)用上面，新CRISPR測試能夠節(jié)省時間和金錢，甚至不再需要去看醫(yī)生就能做出診斷。這種診斷可以在幾分鐘內(nèi)得出明確的陽性或陰性結(jié)果，類似于家庭懷孕自測。測試結(jié)果可以通過手機(jī)上的應(yīng)用程序發(fā)送給醫(yī)生，醫(yī)生可以立即開出處方或給出治療建議。這些測試還可以在醫(yī)院使用，以快速確定感染病原體，以及引起腫瘤的突變基因，或者快速預(yù)測人們是否有罹患某種疾病的遺傳基因。

相比qPCR技術(shù)，CRISPR核酸檢測技術(shù)主要有哪些優(yōu)勢？CRISPR核酸檢測技術(shù)產(chǎn)業(yè)化尚需解決的核心問題有哪些？從國外的技術(shù)和臨床試驗對比來看，國內(nèi)CRISPR核酸檢測技術(shù)正處于怎樣的發(fā)展階段？

王弢：

相比qPCR，CRSIPR核酸檢測技術(shù)擁有獨特優(yōu)勢：

①復(fù)雜背景下的高靈敏度，可對aM（10-18M）濃度的靶核酸分子進(jìn)行高效檢測；而qPCR技術(shù)很難實現(xiàn)復(fù)雜背景下靶分子的有效擴(kuò)增。

②復(fù)雜背景下的高特異性。CRISPR核酸檢測技術(shù)具有極為優(yōu)異的抗干擾性能，可實現(xiàn)對單堿基異常的精確監(jiān)測；qPCR影響因素多，抗干擾能力差，難以避免假陽的存在。

③更為簡易的操作，無需依賴較大的儀器，10-60分鐘內(nèi)完成擴(kuò)增全程；qPCR依賴多步驟的復(fù)雜操作，嚴(yán)格環(huán)境控制，耗時1-3小時，需要復(fù)雜的大型精密儀器。

張明東：

CRISPR核酸檢測技術(shù)具有高靈敏度、高特異性和極為顯著的抗干擾等優(yōu)勢，但如何實現(xiàn)核酸預(yù)擴(kuò)增和CRISPR一體化反應(yīng)是一個難題，以及如何實現(xiàn)單人份或高通量快速檢測也是不同場景下應(yīng)用的需要，還有各種關(guān)鍵生物酶的產(chǎn)業(yè)化是需要解決的核心問題。

王弢：

國內(nèi)CRISPR核酸檢測技術(shù)的發(fā)展處于快速發(fā)展的起步階段，整個產(chǎn)業(yè)鏈還不是很成熟。成熟的CRISPR核酸檢測技術(shù)如果應(yīng)用于院外場景，需做到：

①快速，通常1小時內(nèi)完成檢測。

②防污染，全封閉操作。

③高性能，靈敏度和特異性高于或等同于qPCR。

④便捷，各檢測試劑All in于一管。

⑤常溫儲運。

結(jié)束語

基因組中的微小改變，會帶來有機(jī)體的巨大變化。隨著科研人員對生命系統(tǒng)的研究不斷深入和資本市場的強力支持，我們有理由相信，在不遠(yuǎn)的將來，我們將會看到CRISPR/Cas更加廣泛、成熟地運用于臨床，有效治療各種遺傳疾病。但值得警惕的是，這項革命性的技術(shù)也是一把雙刃劍，只有完善相關(guān)法律法規(guī)，厘清科技與倫理的邊界，規(guī)范科研行為，才能引導(dǎo)基因編輯領(lǐng)域的健康發(fā)展。

參考資料

近日，一篇發(fā)表在國際雜志Nature Communications上題為“A systematic genome-wide mapping of oncogenic mutation selection during CRISPR-Cas9 genome editing”的研究報告中，來自美國國立衛(wèi)生研究院等機(jī)構(gòu)的科學(xué)家們通過研究發(fā)現(xiàn)，基于CRISPR/Cas的基因編輯（尤其是基因敲除）或許會讓正常細(xì)胞產(chǎn)生與癌癥相關(guān)的基因突變形式，“基因剪刀”再引爭議。

本文中的觀點僅代表受訪者個人觀點，并不一定反映安永全球機(jī)構(gòu)或其成員機(jī)構(gòu)的觀點。

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